高效液相色譜儀(HPLC)現已成為有機化學(xué)分析的重要手段之一。同樣，在食品分析中，無(wú)論是殘留分析還是成分分析，HPLC也已成為*的分析儀器。和其它分析儀器一樣，你若想讓HPLC很好地為你工作、得到可靠的數據，首先你要保養好它，使它處于一個(gè)良好的待機狀態(tài)，這樣你操作它進(jìn)行分析時(shí)就可以比較順利地獲得理想的結果。而且良好規范的操作習慣可以延長(cháng)儀器使用壽命。
大家在學(xué)?；蚪邮軆x器公司培訓的時(shí)候，老師或工程師會(huì )提出很多的操作注意事項。但要是總結歸納一下，重要的有三點(diǎn)：脫氣、過(guò)濾和沖洗。本文圍繞這三點(diǎn)進(jìn)行討論，給新從事HPLC分析的工作者一點(diǎn)操作建議，希望能對正確的操作儀器有一點(diǎn)幫助。更歡迎有經(jīng)驗的專(zhuān)家介紹使用經(jīng)驗，提出好建議。
一、脫氣
流動(dòng)相脫氣對于避免HPLC系統出問(wèn)題，順利得到一個(gè)理想的數據是一個(gè)很有效的措施。HPLC系統內是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時(shí)要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當氣泡存在時(shí)，你將觀(guān)察到瞬間的流速降低和系統壓力下降。如果這個(gè)氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預先設定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設計可以很好地排除氣泡，而也有一些泵設計當氣泡存在時(shí)將停止運轉。
當一個(gè)氣泡通過(guò)輸液泵時(shí)，由于系統壓力大，氣泡通常會(huì )溶解在流動(dòng)相溶液中，隨流動(dòng)相通過(guò)柱子。但是到達檢測器流通池時(shí)系統壓力又恢復到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現，在色譜圖上會(huì )出現不規律的毛刺。為解決這個(gè)問(wèn)題，有些儀器公司設計一個(gè)反壓控制器，這樣可以在檢測器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動(dòng)相中直到它們流出檢測器。當然，這個(gè)壓力不能超過(guò)流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測器。
紫外/可見(jiàn)光(UV/VIS)檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過(guò)流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也非常敏感，但表現出的征兆與UV/VIS不同，例如有報導說(shuō)，當使用熒光(FL)檢測器時(shí)，流動(dòng)相中溶解氧的存在可能會(huì )使一些化合物失去熒光性。此外，對于利用待測物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應引起電流變化而進(jìn)行檢測的電化學(xué)(EC)檢測器，對流動(dòng)相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時(shí)還會(huì )導致保留時(shí)間不重現。
所以，必須注意消除流動(dòng)相中的空氣，并且還應避免空氣由管路(如PTFE管)滲透進(jìn)流動(dòng)相中。
如果適當地關(guān)注在使用之前脫去流動(dòng)相中溶解進(jìn)的空氣，上述這些問(wèn)題均能避免，或把影響降至低。常用的脫氣方法有如下幾種：
1、吹氦脫氣法：利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動(dòng)相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動(dòng)相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個(gè)高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動(dòng)相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著(zhù)1L氦氣通過(guò)1L流動(dòng)相就可完成排氣這個(gè)工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國內氦氣價(jià)格較高，很少有實(shí)驗室采用此方法。
2、加熱回流法：此法的脫氣效果較好。在操作時(shí)要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會(huì )丟失，混合流動(dòng)相的比例會(huì )有變化。
3、抽真空脫氣法：此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會(huì )使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實(shí)驗的重現性，因此多用于單溶劑體系的簡(jiǎn)單分析。
4、超聲波脫氣法：將欲脫氣的流動(dòng)相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果zui差。
5、在線(xiàn)脫氣法：現在商品的HPLC儀器，均可配在線(xiàn)脫氣機。在線(xiàn)脫氣使用簡(jiǎn)單，低故障，有效。建議購買(mǎi)儀器時(shí)一定要購買(mǎi)，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時(shí)應與公司確認。
二、過(guò)濾
任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統后都會(huì )在柱子入口端被篩板擋住，zui后的結果是將柱子堵塞，表現出的特征是系統壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過(guò)濾設計，努力防止或減少顆粒物進(jìn)入HPLC系統中，從而延長(cháng)儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數據的可靠性。在HPLC系統中，顆粒物的主要來(lái)源有三個(gè)途徑：流動(dòng)相、被測樣品和儀器系統部件的磨損物。
1、流動(dòng)相
如果流動(dòng)相均由高效液相色譜級溶劑組成，流動(dòng)相沒(méi)有必要過(guò)濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過(guò)程中都已經(jīng)過(guò)了0.2µm微孔濾膜過(guò)濾。同樣的，無(wú)論你是買(mǎi)的HPLC級的水還是在實(shí)驗室使用超純水凈化系統制備的水，zui后一步也是通過(guò)0.2µm微孔濾膜。然而，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸鹽，流動(dòng)相過(guò)濾將是必要的一個(gè)步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內蓋時(shí)，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會(huì )產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能*溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動(dòng)相中成為殘渣。
流動(dòng)相通過(guò)0.45µm微孔濾膜過(guò)濾對于從流動(dòng)相中除去所有顆粒物是一個(gè)有效方法。0.2µm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個(gè)應用而言并不比0.45µm微孔濾膜更有效，而且它的過(guò)濾速度會(huì )更慢，特別是當實(shí)驗室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時(shí)。建議實(shí)驗室在編寫(xiě)制定他們流動(dòng)相制備標準操作程序(SOPs)時(shí)規定，可以借鑒上同類(lèi)實(shí)驗室的規定，即：
流動(dòng)相制備僅采用HPLC級液體時(shí)不需要過(guò)濾，反之所有流動(dòng)相組成在使用前必須過(guò)濾。
在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過(guò)濾器(常見(jiàn)材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種)也是很重要的。這個(gè)過(guò)濾器的規格為≥10µm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動(dòng)相過(guò)濾步驟，但是它能除去系統中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。
2、被測樣品
液相系統中的第二個(gè)顆粒物來(lái)源是被測樣品。一些實(shí)驗室在將他們的樣品放置在自動(dòng)進(jìn)樣器盤(pán)(或手動(dòng)進(jìn)樣)以前，所有樣品都先通過(guò)一個(gè)0.45µm針筒式過(guò)濾器過(guò)濾。這是一個(gè)有效除去被測樣品中顆粒物的方法。但是這個(gè)過(guò)程也有一點(diǎn)需要關(guān)注：你使用了針筒式過(guò)濾器就不可能100%得到通過(guò)過(guò)濾器的被測樣品，總會(huì )有或多或少的丟失。丟失來(lái)自這樣幾方面：過(guò)濾器濾膜的吸附、過(guò)濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過(guò)濾器與針筒連接處的滲漏等。如果有丟失，過(guò)濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？這個(gè)問(wèn)題一般需要通過(guò)實(shí)驗確認。確認這步是要增加工作量和費用的。過(guò)濾器的使用是一種消耗，每個(gè)過(guò)濾器的價(jià)格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時(shí)，由于基質(zhì)大多比較復雜，所以過(guò)濾這步已成為*的一步。在實(shí)際分析工作中，一般檢測每一組樣品會(huì )帶一個(gè)外標、一個(gè)添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要zui終檢測時(shí)得到的信噪比能滿(mǎn)足檢出限要求，可將這步視為系統誤差而忽略。
3、儀器系統部件的磨損物
后，在HPLC系統中顆粒物的另一個(gè)主要來(lái)源是輸液泵密封墊和進(jìn)樣閥旋轉軸的磨損。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。
一種建議認為，在一般實(shí)驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個(gè)月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實(shí)驗室應基于上述觀(guān)點(diǎn)制定定期預防性維護計劃。該觀(guān)點(diǎn)認為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費用相比，更換密封墊的費用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來(lái)的顆粒物，防止這些顆粒物隨流動(dòng)相流至柱頭。若有這種裝置應查閱輸液泵操作手冊，查看推薦的這種過(guò)濾器清洗或更換的間隔。
另一種建議則認為，原裝密封墊的密封效果較好，更換以后容易引起流動(dòng)相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。
兩種說(shuō)法都有其道理，具體如何操作，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的。
自動(dòng)進(jìn)樣器旋轉軸的密封隨著(zhù)使用時(shí)間也會(huì )磨損，但是在我的經(jīng)驗中，即便是高負荷的運轉旋轉軸密封墊也可以使用幾年。如果你的自動(dòng)進(jìn)樣器系統有計數進(jìn)樣閥轉動(dòng)次數的功能，你可以設定一個(gè)警鈴當預設閥轉動(dòng)次數已達到時(shí)提醒你。曾有一種說(shuō)法，進(jìn)樣器多轉動(dòng)20,000次，這僅僅是進(jìn)樣10000個(gè)；但這似乎不是實(shí)驗室涉及的常規樣品分析使用壽命，它們的實(shí)際使用壽命會(huì )更長(cháng)。旋轉軸密封磨損后會(huì )滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進(jìn)樣后，峰面積值差別比較大(RSD>5%)。當然，輸液泵的密封墊和旋轉軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在流動(dòng)相中，加速對這些部件的損傷。
此外，如果你日常運行的流動(dòng)相有緩沖鹽，如磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會(huì )更快。無(wú)論顆粒物源于何物，實(shí)驗時(shí)都要將其除去。推薦在HPLC系統中采用一個(gè)0.45或0.5µm的在線(xiàn)多孔過(guò)濾器，接在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子之間，即使已使用了保護柱。這個(gè)在線(xiàn)過(guò)濾器將成為擋板代替柱頭的濾板，而且如采用一個(gè)玻璃砂芯濾板，既便宜，更換又方便(幾分鐘就可更換)。若采用在線(xiàn)過(guò)濾，HPLC系統檢測每批樣品開(kāi)始前記錄下壓力值，當壓力上升一定值，例如25%或增加500psi，應該更換玻璃砂芯濾板了，更換以后沖洗幾分鐘系統將恢復到原來(lái)的壓力值。
三、沖洗
使HPLC系統良好運行的第三個(gè)要點(diǎn)是保持系統的清潔。你需要關(guān)注流動(dòng)相流經(jīng)該系統的所有地方，對于這些地方經(jīng)常性的沖洗，將使你的系統保持在“Ready”狀態(tài)。
1、流動(dòng)相儲液瓶
首先要經(jīng)常清洗流動(dòng)相儲液瓶，或者每做一批新樣品更換一次流動(dòng)相。一個(gè)臟的儲液瓶將會(huì )污染注入的流動(dòng)相。建議儲液瓶中緩沖液使用時(shí)間不要超過(guò)一周，而有機溶劑使用時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)月。也有人建議儲液瓶中保持用溶劑充滿(mǎn)，直到更換分析方法儲液瓶需更換新溶劑(流動(dòng)相組成發(fā)生變化)時(shí)，將舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于將溶劑用完。但這對于分析樣品量少的實(shí)驗室而言似乎有些浪費。儀器公司的工程師建議儲水瓶的水要天天換，每周瓶子還應該用異丙醇清洗一次。有的實(shí)驗室則在水里加入0.1～1mM的甲酸抑制微生物的生長(cháng)。這些做法看起來(lái)有些繁瑣，但卻能起到“磨刀不誤砍柴工”作用。
2、泵
接下來(lái)要沖洗的是泵。千萬(wàn)不要一分析完沖幾分鐘后就停泵，特別是當流動(dòng)相中含有難揮發(fā)的緩沖液(如磷酸鹽)時(shí)。如果儀器不是連續使用，當流動(dòng)相蒸發(fā)時(shí)，難揮發(fā)物就會(huì )粘在活塞密封墊的表面，難揮發(fā)物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以，無(wú)論使用長(cháng)短，在停泵以前一定要用非緩沖液流動(dòng)相沖洗泵在半個(gè)小時(shí)以上，要是流動(dòng)相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時(shí)間應該更長(cháng)些。
3、自動(dòng)進(jìn)樣器
自動(dòng)進(jìn)樣器也要按規定清洗?，F在的儀器多配有自動(dòng)進(jìn)樣器的沖洗液瓶，通常只要注意及時(shí)更換、補充沖洗液即可。自動(dòng)進(jìn)樣器用的洗滌液也要采用與流動(dòng)相相同的方式處理，并根據溶劑的有效期和規定，清洗儲液瓶或更換洗滌液?，F在的自動(dòng)進(jìn)樣器設置、操作都很簡(jiǎn)單，如果時(shí)間允許(特別是利用夜間運行)，每次分析完后設置進(jìn)1、2針純溶劑(如甲醇、乙腈)，也是一個(gè)好做法。
4、色譜柱
對柱子的污染是隨使用時(shí)間而增加。通常表現是：運行走基線(xiàn)時(shí)在記錄的色譜圖中基線(xiàn)噪音增加，泵壓也增加。解決這個(gè)問(wèn)題的zui有效方法就是在每一批樣品分析結束后或準備卸下柱子時(shí)用大量的流動(dòng)相沖洗柱子(例如，甲醇、乙腈和水)。用梯度沖洗效果更好，具體的比例要根據柱子的說(shuō)明書(shū)和性質(zhì)而定。
5、檢測器
如果是正常使用，檢測器將依據其性質(zhì)并按照說(shuō)明書(shū)規定進(jìn)行洗。例如UV/VIS檢測器或FL檢測器，在對柱子和系統進(jìn)行沖洗時(shí)也就一同對檢測器流通池中污染物進(jìn)行了清洗。但是蒸發(fā)光檢測器或質(zhì)譜儀則需要按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定期清洗。這些檢測器在使用時(shí)會(huì )有難揮發(fā)污染物沉積，如質(zhì)譜儀離子源的噴針、毛細管、錐孔板、預四極等部件，因而需要定期清洗。而且對聯(lián)有這些檢測器的系統沖洗時(shí)，建議與這些檢測器斷開(kāi)，以減少對檢測器的污染。
總之，實(shí)驗室日常使用的液相色譜儀要是能認真做好這三項工作——脫氣、過(guò)濾和沖洗，你的儀器可以得到良好的預防性維護，使用時(shí)就會(huì )感到比較順手。當然，在實(shí)際操作時(shí)遇到的問(wèn)題并沒(méi)有這么簡(jiǎn)單，但這三個(gè)良好習慣將是正確操作、使用HPLC系統的基礎。
